Cristalografía de rayos X

Proceso de determinación de la estructura de una molécula por cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X es una técnica experimental para el estudio y análisis de materiales, basada en el fenómeno de difracción de los rayos X por sólidos en estado cristalino.

Los rayos X interactúan con los electrones que rodean los átomos por ser su longitud de onda del mismo orden de magnitud que el radio atómico. El haz de rayos X emergente tras esta interacción contiene información sobre la posición y tipo de átomos encontrados en su camino. Los cristales, gracias a su estructura periódica, dispersan elásticamente los haces de rayos X en ciertas direcciones y los amplifican por interferencia constructiva, originando un patrón de difracción.​ Existen varios tipos de detectores especiales para observar y medir la intensidad y posición de los rayos X difractados, y su análisis posterior por medios matemáticos permite obtener una representación a escala atómica de los átomos y moléculas del material estudiado.

Max von Laue realizó los primeros experimentos de cristalografía de rayos X en 1912. Von Laue, William Henry Bragg y William Lawrence Bragg desarrollaron inicialmente la teoría de difracción de cristales, tarea a la que pronto se sumaron otros científicos. A lo largo del siglo XX tuvieron lugar varios avances teóricos y técnicos, como la aparición de los superordenadores y el uso de sincrotrones para la producción de rayos X, que resultaron en un creciente capacidad del método para determinar las propiedades estructurales de todo tipo de moléculas: sales, materiales inorgánicos complejos, proteínas y hasta componentes celulares como los ribosomas. Es posible trabajar con monocristales o con polvo microcristalino, consiguiéndose diferentes datos en ambos casos. Para las aplicaciones que requieren solo una caracterización precisa de los parámetros de la red cristalina, puede ser suficiente la difracción de rayos X por polvo; para una dilucidación precisa de las posiciones atómicas se prefiere trabajar con monocristales.

La mayor limitación de este método es la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos, por lo que no es aplicable a disoluciones, a sistemas biológicos in vivo, a sistemas amorfos o a gases. En algunos casos, los rayos X pueden romper los enlaces químicos que mantienen la integridad estructural, lo que resulta en un modelo distorsionado de la molécula estudiada. Este problema afecta especialmente a los materiales de interés biológico.

Historia

Primeros experimentos

Pioneros de la cristalografía de rayos X. De arriba abajo: William H. Bragg, su hijo William L. Bragg y Max von Laue.

La idea de que los cristales eran una repetición periódica de un grupo de moléculas ya existía anteriormente a que Wilhelm Conrad Röntgen descubriera los rayos-X en 1895. Aunque las distancias típicas entre los planos del la red cristalina se desconocían, se sabía que debían ser muy pequeñas comparadas con la longitud de onda de la luz visible. Esto dio la idea al físico alemán Max von Laue de utilizar cristales de sulfato de cobre para determinar si los rayos X se componían de partículas u ondas: dedujo que, si fueran ondas, deberían generar un patrón de difracción al atravesar los cristales.​ Los experimentos se realizaron en 1912, con la ayuda de Walter Friedrich y Paul Knipping, ambos antiguos estudiantes de Röntgen. Estos experimentos confirmaron la presencia de difracción cristalina.

Poco después, los británicos William Henry Bragg y William Lawrence Bragg (padre e hijo respectivamente) reprodujeron el experimento. W.L. Bragg explicó la difracción como la interferencia de los rayos X reflejados por el cristal, introduciendo la descripción conocida desde entonces como la ley de Bragg.​ En 1913, Paul Ewald demostró que las dos interpretaciones de los resultados publicadas independientemente por von Laue y Bragg eran equivalentes.​ Von Laue recibió el premio Nobel de Física en 1914 por su descubrimiento del fenómeno, y los Bragg recibieron el premio un año más tarde por su trabajo en las aplicaciones prácticas.​​Hacia el final de la década, se había logrado determinar las longitudes de onda de los rayos X y la estructura de varios compuestos inorgánicos simples y las bases teóricas de la técnica se habían establecido gracias al trabajo de los ya mencionados investigadores, Charles Galton Darwin​ y Peter Debye, entre otros.

El desarrollo de la técnica: 1920-1960

El período entre 1920 y 1960 se caracterizó por importantes adelantos metodológicos que propiciaron el empleo de la diffracción de rayos X para analizar estucturas de moléculas más complejas.

Durante la década de los 20, los avances de la teoría cuántica sirvieron para caracterizar más precisamente la interacción entre los rayos X y los átomos de los cristales; esto posibilitó el análisis correcto de la intensidad de la difracción. En la misma época aparecieron las tablas para determinar la simetría cristalina a partir de la distribución de reflexiones en el patrón de difracción y se empezaron a usar las series de Fourier para representar la distribución de electrones en la red cristalina. Los desarrollos en la representación matemática de la densidad electrónica continuaron hasta la Segunda Guerra Mundial, facilitando la obtención de las primeras estructuras de moléculas orgánicas. En 1935, el cristalógrafo británico Arthur Patterson descubrió un truco matemático para obtener las distancias interatómicas directamente a partir de los datos experimentales, lo que supuso un importante avance en el análisis de la difracción.​

Entre los años 40 y 60, surgieron otros procedimientos para la determinación de estructuras, con especial énfasis en métodos heurísticos basados en el proceso de ensayo y error, que demostraron ser bastante robustos en combinación con restricciones condicionantes basadas en las propiedades físicas de una estructura correcta, como por ejemplo, que la densidad electrónica debe ser siempre positiva. En este período la cristalografía empezó a adquirir importancia en el campo de la química orgánica, proceso que culminó con la determinación en 1957 de la estructura de la vitamina B12, un proyecto liderado por Dorothy Hodgkin.​

Avances en cristalografía de macromoléculas: 1960-1980

El evento de más impacto durante las décadas de los 60 y 70 fue el reconocimiento de la cristalografía de proteínas y de moléculas biológicas en general como área de investigación clave en la biología molecular. El año 1962 marcó un hito al otorgarse dos premios Nobel por los resultados obtenidos usando métodos cristalográficos en esta área: El premio Nobel de Química fue concedido a Max Perutz y John Kendrew por sus estudios cristalográficos de las proteínas hemoglobina y mioglobina y el premio Nobel de Medicina a Francis Crick, James Watson y Maurice Wilkins por descubrir que el ADN forma una doble hélice.​ En 1964 Dorothy Hodgkin también obtuvo el premio Nobel de Química por la determinación de varias estructuras de importancia biológica, como la penicilina y la vitamina B12, entre otras.​

Un adelanto que facilitó en gran medida el éxito de las técnicas cristalográficas tanto en los casos más complejos como en el de moléculas de menor tamaño fue el desarrollo de ordenadores digitales; gracias a ellos fue posible usar programas para medir y analizar fácilmente los datos obtenidos en los experimentos en vez de realizar los laboriosos cálculos manualmente.​ Sin embargo, al final de este período el estudio de proteínas estaba aún limitado por la ausencia de fuentes de rayos X intensos y el empleo de película fotográfica para medir los patrones de difracción, lo que requería un largo proceso de revelado y digitalización de las imágenes.​ A consecuencia de estas limitaciones, y a pesar del reconocimiento generalizado del potencial de la cristalografía para estos experimentos, a finales de los años 70 el Banco de Datos de Proteínas solo contaba con unas sesenta entradas.​

Expansión y madurez: 1980-2010

Modelo cristalográfico de la subunidad mayor del ribosoma. La obtención de esta estructura, galardonada con el premio Nobel de Química en 2009, fue posible gracias a los avances tecnológicos y metodológicos de los años 1980 y 1990. Como comparación, a la derecha y aproximadamente en la misma escala, se muestra el modelo de la mioglobina, una de las primeras proteínas estudiadas con esta técnica durante los años 1950 y cuya determinación se consideró un logro considerable en esa época.

Los tubos de rayos X, con sucesivas mejoras, se utilizaron como la fuente primordial de rayos X para los experimentos de cristalografía desde sus comienzos hasta la década de 1970, época en la que se empezó a experimentar con la radiación sincrotrón de rayos X. Los sincrotrones dedicados exclusivamente a la producción de rayos X aparecieron en los años 80 y su número no ha dejado de aumentar desde entonces.​ En la primera década del siglo XXI se construyeron los primeros láseres de electrones libres de rayos-X, capaces de producir haces de luz pulsada de una intensidad de órdenes de magnitud mayor que en las fuentes de luz sincrotrón convencionales. La duración de los pulsos de luz, del orden de femtosegundos ofrece la posibilidad de observar cambios en los cristales a escalas temporales inalcanzables anteriormente.​ Durante estos años también se desarrollaron nuevos detectores bidimensionales o «de área», capaces de generar directamente una imagen digitalizada del patrón de difracción. Estos detectores facilitaron la rápida medición y análisis de la difracción y sustituyeron totalemente a las placas fotográficas usuadas hasta entonces.

Estos avances tecnológicos, unidos al incremento de la capacidad de los ordenadores modernos para almacenar y procesar datos, han permitido llevar a cabo experimentos antaño irrealizables, y han desembocado en un aumento exponencial del número de estructuras elucidadas por métodos cristalográficos. Los avances más notables han tenido lugar en el área de las macromoléculas orgánicas, con más de 78 000 estructuras depositadas en el Banco de Datos de Proteínas al comienzo de 2012.​ La obtención en 2000 de la estructura del ribosoma,​ un enorme complejo de ácidos nucleicos y varias proteínas donde tiene lugar la síntesis de proteínas en la célula, ilustra las capacidades que ha alcanzado la técnica.

Aspectos físicos

Cristales y redes cristalinas

Estructura cristalina de cloruro de hidrógeno deuterado con la celda unidad superpuesta sobre las moléculas. La red cristalina se forma mediante la translación de la celda unidad a lo largo de las direcciones definidas por $a,b$ y $c$.

Parámetros de la celda unidad

Los cristales están formados por una repetición periódica de moléculas en tres dimensiones. El cristal se puede representar matemáticamente como una red tridimensional, llamada red de Bravais en la que todas las intersecciones son idénticas.​​ El paralelepípedo definido por las líneas entre las intersecciones de la red se conoce como la celda unidad.​​ La celda unidad se define por la longitud de sus lados $a$, $b$ y $c$ en la dirección de los tres ejes espaciales y los ángulos $\alpha$, $\beta$ y $\gamma$ que los ejes de la red forman entre sí. Las coordenadas de cualquier punto de la red cristalina se pueden expresar como una combinación lineal de los vectores $\mathbf {a}$, $\mathbf {b}$ y $\mathbf {c}$.​

La posición de un átomo en la celda unidad se expresa como coordenadas fraccionales de $\mathbf {a}$, $\mathbf {b}$ y $\mathbf {c}$:

$R=x\mathbf {a} +y\mathbf {b} +z\mathbf {c}$

con las coordenadas ($x$, $y$, $z$) comprendidas entre 0 y 1.​

El objetivo de los experimentos de difracción por rayos X es, averiguar las coordenas $x$, $y$ y $z$ para cada átomo. Para lograrlo es necesario, en primer lugar, determinar la relación entre la red cristalina y la geometría del patrón de difracción y, en segundo lugar, obtener las posiciones de los átomos a partir de la intensidad de la difracción.

Rayos X

Representación esquemática de una onda electromagnética, mostrando la oscilación periódica de los campos eléctrico y magnético.

Los rayos X son un tipo de radiación electromagnética con longitudes de onda entre 10 y 10^-2 nm o energías entre 0.1 y 100 keV.​ Para los experimentos de difracción cristalina se suelen usar rayos X de energía relativamente alta, del orden de 10 keV, correspondiente a longitudes de onda del orden de 0.1 nm.​​

Los rayos X se describen matemáticamente como una onda sinusoidal propagándose a través del espacio. Tomando un punto arbitrario como origen, el valor del campo eléctrico $E$ en función del tiempo $t$ se puede escribir como:​​

$E(t)=A\exp(2\pi ict/\lambda )$

$A$ es la amplitud de la oscilación, $\lambda$ la longitud de onda y $c$ la velocidad de la luz. Al interactuar con los electrones agrupados alrededor de los átomos de la muestra a estudiar la onda sufre un desfase $\alpha$ con respecto a la onda en el origen:

$E(t)=A\exp(2\pi ict/\lambda )\exp(2\pi i\alpha )$

La diferencia de fase depende de la distancia entre el punto de origen y los átomos del material; esto implica que la estructura atómica, es decir, las posiciones que ocupan los átomos, se pueden derivar de la fase de los rayos X que han atravesado el material.

Dispersión elástica de rayos X

El fenómeno de difracción cristalina tiene su origen en la dispersión elástica o scattering elástico del haz de rayos X por los átomos del cristal.​ En este tipo de interacción, el electrón desvía la trayectoria de los rayos X, conservando tanto estos como el electrón su energía inicial. La trayectoria de los rayos X es exactamente la misma que toma un rayo de luz visible reflejado en un espejo, es decir, los rayos dispersados emergen a un ángulo $2\theta$ con respecto a la dirección de los rayos incidentes.​

La dispersión elástica por un grupo de átomos en una dirección dada se puede cuantificar con una cantidad conocida como factor de estructura que es igual a la suma de los rayos reflejados por cada átomo $j$ que interactúa con los rayos incidentes:

$\mathbf {F} (\mathbf {S} )=\sum _{j}f_{j}\exp(2\pi i\mathbf {r} _{j}\cdot \mathbf {S} )$

$f$ es una función llamada factor de forma — o factor de dispersión — atómico que describe la dispersión por todos los electrones del átomo en conjunto. La dispersión elástica atómica depende del número atómico $Z$ y del ángulo de incidencia de los rayos X.​ El cambio de fase de los rayos dispersados durante la interacción viene dado por el producto escalar de $\mathbf {r} _{j}$, el vector entre el origen y cada átomo $j$ y $\mathbf {S}$, el vector de dimensión $2\sin \theta /\lambda$ en la dirección perpendicular al plano virtual de reflexión.

Difracción cristalina

Adición de ondas: cuando las ondas están desfasadas, se aniquilan mutuamente; cuando están en fase, se amplifican.

Ley de Bragg

El fenómeno de difracción es debido esencialmente a la relación entre las fases de todas las ondas reflejadas por cada celda unidad del cristal: las diferencias de camino óptico entre los rayos que han atravesado distintos puntos del cristal, que a su vez producen un cambio en la amplitud de la onda resultante. Cuando las ondas están completamente desfasadas se anulan entre sí. Por el contrario, cuando las ondas están en fase, la amplitud de la onda final es la suma de las amplitudes para cada onda. Puesto que un cristal está compuesto de miles de celdas unidad, la interferencia constructiva entre todas ellas llega a resultar en un haz lo suficientemente intenso para poder ser medido con un detector de rayos X.

Ley de Bragg: Los átomos o grupos de átomos en la red cristalina están representados por esferas (para simplificar el diagrama, la tercera dimensión del cristal no se representa). Las esferas se sitúan sobre planos imaginarios paralelos, perpendiculares al diagrama, separados por $d$. En la imagen de la izquierda, la diferencia en el camino recorrido por las ondas de rayos X dispersadas por los dos planos es un múltiplo entero de la longitud de onda; por lo tanto, las ondas emergentes están en fase y se observa difracción. A la derecha, con un ángulo de incidencia diferente, la Ley de Bragg no se cumple para esta familia de planos cristalinos; las ondas emergentes están desfasadas y no se observa difracción.

La condición para que las ondas estén en fase es que la diferencia de sus caminos ópticos sea cero o un múltiplo entero $n$ de la longitud de onda. En un cristal, la diferencia en el camino óptico entre átomos situados en posiciones equivalentes en distintas celdas unidad es $2d\sin \theta$ donde $d$ es la distancia entre los planos imaginarios que unen los puntos equivalentes de la red cristalina. Es decir, para que se observe difracción de rayos X a un ángulo de observación $2\theta$, se debe cumplir la expresión conocida como Ley de Bragg:​

$n\lambda =2d\sin \theta$

Como en el caso de la dispersión elástica por un átomo, la difracción cristalina se puede interpretar como la reflexión especular de los rayos X por todos los planos del cristal paralelos entre sí separados por la distancia $d$ que cumple la ley de Bragg. Por este motivo, los puntos del patrón de difracción se denominan «reflexiones».​

Índices de Miller: La figura muestra ejemplos de diferentes planos de difracción en una celda unidad, ilustrando la correspondencia entre los índices de Miller ${hkl}$ y la orientación de los planos en el sistema de coordinadas definido por aquella.

Índices de Miller

Para que se cumpla la ley de Bragg para un grupo de planos de reflexión paralelos, estos deben cruzar los ejes de la celda unidad un número entero de veces. Las reflexiones cristalinas se identifican mediante tres números $h$, $k$ y $l$ iguales al número de intersecciones de los planos con los ejes $a$, $b$ y $c$ de la celda. Los números $h$, $k$ y $l$ reciben el nombre de índices de Miller. Matemáticamente los índices de Miller describen un vector perpendicular al plano de reflexión en el sistema de coordenadas definido por la red cristalina.​

La red recíproca

La red recíproca es una construcción matemática que facilita la representación de los planos de reflexión y la visualización de la relación entre la orientación del cristal y el patrón de difracción. Las coordenadas de cada punto de la red recíproca coinciden con los índices de Miller, es decir, cada punto de la red recíproca representa a una familia de planos de Miller en el espacio real de la red cristalina; la distancia del origen a cada punto de la red es $1/d$.​​

Al igual que en el caso de la red cristalina, los puntos de la red recíproca se pueden expresar como una combinación lineal de vectores $\mathbf {a} ^{\ast }$, $\mathbf {b} ^{\ast }$ y $\mathbf {c} ^{\ast }$:​

$\mathbf {r} =h\mathbf {a} ^{\ast }+k\mathbf {b} ^{\ast }+l\mathbf {c} ^{\ast }$

La relación entre los parámetros de la celda unidad ($a$, $b$, $c$, $\alpha$, $\beta$, $\gamma$) de volumen $V$ y la celda unidad recíproca ($a^{\ast }$, $b^{\ast }$, $c^{\ast }$, $\alpha ^{\ast }$,$\beta ^{\ast }$, $\gamma ^{\ast }$) es la siguiente:​​

$a^{\ast }={\frac {bc\sin \alpha }{V}};b^{\ast }={\frac {ac\sin \beta }{V}};c^{\ast }={\frac {ab\sin \gamma }{V}}$

$V^{\ast }=a^{\ast }b^{\ast }c^{\ast }{\sqrt {1-\cos ^{2}\alpha ^{\ast }-\cos ^{2}\beta ^{\ast }-\cos ^{2}\gamma ^{\ast }+2\cos \alpha ^{\ast }\cos \beta ^{\ast }\cos \gamma ^{\ast }}}$

$\cos \alpha ^{\ast }={\frac {\cos \beta \cos \gamma -\cos \alpha }{\sin \beta \sin \gamma }};\cos \beta ^{\ast }={\frac {\cos \alpha \cos \gamma -\cos \beta }{\sin \alpha \sin \gamma }};\cos \gamma ^{\ast }={\frac {\cos \alpha \cos \beta -\cos \gamma }{\sin \alpha \sin \beta }}$

Representación bidimensional de la construcción de Ewald. Los rayos X incidentes están representados por el vector de onda $K_{i}$, de amplitud $1/\lambda$. La red recíproca se representa en azul; por claridad, solo se muestran las coordenadas de algunos puntos, representando a los planos de Miller correspondientes. El punto (4,1) coincide con la superficie de la esfera, por lo tanto se observará un haz de rayos X con el vector de onda $K_{f}$, reflejado en la dirección dada por $2\theta$. La amplitud del vector diferencia entre $K_{i}$ y $K_{f}$ es la distancia entre los planos paralelos de índices (4,1).

La esfera de Ewald

Para visualizar fácilmente los planos de Miller que contribuyen a la difracción en una dirección dada y determinar la relación entre la orientación del cristal y el patrón de difracción, se utiliza la construcción conocida como esfera de Ewald. La esfera de Ewald ilustra todas las posibles direcciones en que los rayos X pueden ser reflejados por el cristal. El radio de esta esfera es $1/\lambda$ y su extremo en la dirección del haz de rayos X incidente coincide con el origen de la red recíproca.​​

Si un punto de la red recíproca de coordenadas $(h,k,l)$ se encuentra sobre la superficie de la esfera de Ewald, los planos de Miller con índices $(h,k,l)$ darán lugar a un punto de difracción en la dirección definida por el centro de la esfera y ese punto de la red recíproca. La distancia entre el origen y $(h,k,l)$ es $1/d$, por lo que se puede demostrar geométricamente que esta condición de difracción es equivalente a la ley de Bragg.​

El factor de estructura cristalino

El vector con coordenadas $(h,k,l)$ en la red recíproca, es perpendicular al plano de reflexión y tiene amplitud $1/d=2\sin \theta /\lambda$; es decir, es el vector $\mathbf {S}$ introducido en la definición del factor de estructura $\mathbf {F} (\mathbf {S} )$ para un conjunto de átomos. Por lo tanto, el factor de estructura en la dirección definida por los planos de Miller descritos por los índices $(h,k,l)$ se reformula como:​​

$\mathbf {F} _{hkl}=\sum \limits _{j}f_{j}\exp(2\pi i\mathbf {r} _{j}\cdot \mathbf {S} )=\sum \limits _{j}f_{j}\exp(2\pi i(x_{j}h+y_{j}k+z_{j}l))$

donde $(x,y,z)$ es el vector de coordenadas del átomo $j$ en el sistema definido por la celda unidad y la suma se realiza para todos los átomos contenidos en ella. En lugar de sumar las contribuciones de cada átomo, también se puede realizar una integración sobre los electrones en el volumen $V$ de la celda unidad, cuya distribución se representa por la función de densidad electrónica $\rho (x,y,z)$:​

$\mathbf {F} _{hkl}=V\int _{x}\int _{y}\int _{z}\rho (x,y,z)\exp(2\pi i(xh+yk+zl))dxdydz$

Representación vectorial de la Ley de Friedel en la ausencia de absorción. Las magnitudes de los factores de estructura relacionados por esta ley, conocidos como «pares Friedel» son iguales, y sus fases, opuestas.

La aplicación de las operaciones de simetría del cristal a las coordenadas $(x,y,z)$ resulta en relaciones de igualdad entre los factores de estructura de diferentes reflexiones. A las reflexiones así relacionadas se las denomina «simétricamente equivalentes». En los experimentos cristalográficos, donde el grupo de simetría no se conoce con certeza a priori, se comparan las intensidades de reflexiones relacionadas por diversas operaciones de simetría para caracterizar la simetría del cristal. La relación

$|\mathbf {F} _{hkl}|=|\mathbf {F} _{{\bar {h}}{\bar {k}}{\bar {l}}}|$

se conoce como ley de Friedel y ocurre incluso si no existe simetría, aparte de la traslación de la celda unidad sobre la red cristalina.​ En la práctica la ley de Friedel no se cumple exactamente debido a la presencia de interacciones inelásticas entre los rayos X y los átomos, que resultan en absorción de energía por estos.​ Esos efectos suelen ser pequeños comparados con las interacciones elásticas y no se suelen tener en cuenta, excepto para longitudes de onda en la vecindad de una discontinuidad de absorción del cristal.

El problema de las fases

El propósito de los experimentos cristalográficos no es obtener el patrón de difracción, sino el valor de la función de distribución electrónica $\rho (x,y,z)$. Se puede demostrar que esta puede representarse como sumas de Fourier de los factores de estructura en todas las direcciones:​

$\rho (x,y,z)={\frac {1}{V}}\sum \limits _{h}\sum \limits _{k}\sum \limits _{l}\mathbf {F} _{hkl}\exp(-2\pi i(xh+yk+zl))$

Mientras que el módulo de los factores de estructura se puede calcular fácilmente a partir de la intensidad del punto de difracción medido por un detector sensible a los rayos X, la fase no se puede medir directamente. Esto se conoce como el «problema de las fases».​ Existen varios métodos para resolver el problema de las fases y elucidar la estructura atómica, clasificados en los siguientes grupos:​

• Métodos de Patterson
• Métodos directos
• Dispersión anómala
• Reemplazamiento isomorfo
• Reemplazamiento molecular

Métodos de Patterson

La función de Patterson se calcula efectuando la síntesis de Fourier con el cuadrado de los factores de estructura $|F_{hkl}|^{2}$ como coeficientes. Esta función se puede calcular directamente a partir de los datos experimentales, al no depender de la fase de los factores de estructura. En 1935, Arthur Patterson se percató de que los máximos de esta función corresponden a los vectores que se pueden trazar entre cada par de átomos en la celda unidad, lo cual se puede utilizar en ciertos casos favorables para determinar la posición de todos o algunos átomos. En particular, el análisis de la función de Patterson se utiliza a menudo para localizar los átomos causantes de diferencias isomorfas o anómalas, lo cual es a su vez el primer paso para solucionar el problema de las fases por estos otros métodos.​​​

Métodos directos

La función de distribución de densidad electrónica $\rho (x,y,z)$ se caracteriza por ser siempre positiva y alcanzar valores máximos alrededor de los átomos. Estas y otras propiedades derivadas de principios físicos básicos, expresadas en forma matemática, se utilizan para discriminar entre valores de las fases que son probables y los que no y de esta manera elucidar la estructura de la molécula de interés. Este método se usa corrientemente para resolver el problema de las fases para moléculas pequeñas.​ En contraste, en el caso de los cristales de macromoléculas, los métodos directos no suelen ser suficientes para resolver la estructura totalmente ab initio sin ninguna información experimental adicional; esto se debe a que, por un lado, los cristales de proteínas y moléculas de similar tamaño raramente difractan a una resolución suficiente para obtener el número de reflexiones requerido para determinar todos los parámetros atómicos y, por otro lado, al gran número de átomos en la celda unidad, que causa que las relaciones entre las probabilidades de las fases sean menos determinantes que en los casos de moléculas que cuentan con pocos átomos.​​

A pesar de los límites del método, sus principios también se aplican en el área de difracción de macromoléculas para mejorar las fases obtenidas por otros métodos y el cálculo de las fases a partir de un modelo de baja resolución. En la cristalografía de proteínas, las propiedades claves para discriminar entre fases correctas e incorrectas incluyen:​

• El contraste entre las zonas de la celda unidad ocupadas por moléculas de agua o solvente en estado amorfo y las zonas ordenadas ocupadas por la molécula.
• Una distribución característica de la probabilidad de valores de la densidad electrónica.

Al igual que la función de Patterson, los métodos directos también se utilizan para determinar las posiciones de átomos especiales en los métodos de sustitución o remplazamiento isomorfo y de dispersión anómala.

Reemplazamiento isomorfo

El reemplazamiento isomorfo o sustitución isomorfa es un método para resolver el problema de las fases empleado predominantemente en cristalografía de macromoléculas. Consiste en la introducción en el medio de cristalización de un compuesto químico de pequeño tamaño conteniendo un átomo pesado, es decir de un número atómico elevado. Los compuestos de mercurio, platino, uranio, y oro son los más utilizados, entre muchos otros.​​ Para que el método tenga éxito se debe establecer un enlace químico entre la molécula de interés y el átomo pesado, y la molécula modificada o «derivada» debe formar cristales isomorfos, con la misma simetría que los obtenidos a partir de la molécula «nativa» sin modificar. El factor de estructura de la molécula derivada $\mathbf {F} _{hkl}^{PH}$ es la suma del factor de estructura «nativo» $\mathbf {F} _{hkl}^{P}$ y la contribución del átomo pesado $\mathbf {F} _{hkl}^{H}$.

Las fases del átomo pesado que contribuyen a esto se puede deducir por métodos directos a partir de las diferencias $\mathbf {F} ^{PH}-\mathbf {F} ^{P}$. Aunque una sola sustitución isomorfa no es suficiente para determinar $\mathbf {F} ^{P}$, si se repite el proceso con al menos una segunda estructura derivada diferente, es posible determinar las fases para la estructura nativa, por el método conocido como reemplazamiento isomorfo múltiple o sus siglas en inglés MIR (Multiple Isomorphous Replacement)​​

Las principal limitación de este método estriba en la dificultad de encontrar compuestos que reaccionen con la molécula a estudiar sin destruir al mismo tiempo el cristal o modificar sensiblemente su simetría o las dimensiones de la celda unidad.

Dispersión anómala

El factor de forma atómica $f$ no solo describe la dispersión elástica sino también el efecto fotoeléctrico, que tiene lugar cuando los electrones cambian su estado cuántico al absorber parte de la energía de los rayos X. El término que corresponde a la dispersión inelástica o «anómala» es un número complejo $f_{A}=f'_{A}+if''_{A}$.​ Ambas componentes real $f'_{A}$ e imaginaria $f''_{A}$ alteran la magnitud de los factores de estructura. La componente imaginaria, relacionada con el coeficiente de absorción, introduce además un cambio de fase que resulta en diferentes magnitudes de los pares Friedel $\mathbf {F} _{hkl}$ y $\mathbf {F} _{{\bar {h}}{\bar {k}}{\bar {l}}}$, idénticas en ausencia de este efecto.

La contribución anómala al factor de estructura es menor que la contribución elástica $f_{0}$ y a menudo no es necesario tenerla en cuenta. Sin embargo, $f_{A}$ depende de la longitud de onda de los rayos X y experimenta grandes variaciones cuando la energía del haz incidente es similar a la energía de un nivel atómico del átomo. Cuando $f'_{A}$ y $f''_{A}$ alcanzan sus valores máximos los cambios en la magnitud y fase de los factores de estructura pueden ser significativos. Si algunos átomos en la molécula resultan afectados por este tipo de interacción, se pueden hallar sus posiciones en la celda unidad analizando las diferencias en la intensidad entre las reflexiones medidas a distintas longitudes de onda, o entre los pares de Friedel a la misma longitud de onda. Dichas diferencias se pueden utilizar para resolver el problema de las fases, por el método MAD (Multiwavelength Anomalous Dispersion o ‘dispersión anómala a múltiples longitudes de onda’)​ o SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion o ‘dispersión anómala a una sola longitud de onda’)​

La mayoría de los átomos pesados usados en el método de reemplazamiento isomorfo exhiben una dispersión anómala importante en el rango de longitudes de onda usadas en los experimentos cristalográficos, por lo cual estas dos técnicas se pueden usar en conjunción. La ventaja de los métodos basados en la dispersión anómala es que, al precisar en principio solo un cristal para determinar las fases, no están limitados por un isomorfismo imperfecto. El uso de radiación sincrotrón, que se puede sintonizar a las longitudes de onda que optimizan la dispersión anómala, ha resultado en un fuerte incremento de la popularidad del método.

Reemplazamiento molecular

El método de reemplazamiento molecular consiste en usar una molécula de estructura conocida para calcular las fases iniciales de una segunda molécula con elementos estructurales comunes con la primera. Este es el método más usado para determinar la estructura de macromoléculas como las proteínas, ya que muchas de ellas se agrupan en familias con una estructura similar o forman complejos supramoleculares en los que se conoce la estructura de una o más componentes.​​

Una desventaja de este método es que las fases obtenidas están sesgadas hacia la estructura utilizada como punto de partida. Esto no ocurre con las técnicas basadas enteramente en los datos de difracción experimentales y consideraciones químicas o estructurales generales. El éxito de este método depende de procedimientos sofisticados para detectar y eliminar este sesgo durante el refinamiento de las fases, evitando que algunas diferencias importantes entre las dos moléculas pueden pasar desapercibidas.​

La obtención de las fases permite calcular un mapa de densidad electrónica (mostrado en blanco), a partir del cual se construye el modelo de la estructura. El modelo suele consistir en líneas, representando los enlaces atómicos, o puntos, representando átomos individuales. En la figura se usan ambas representaciones.

Refinamiento de la estructura

Una vez calculada la función $\rho (x,y,z)$ a partir de las fases, se puede construir un modelo de la estructura en el mapa de densidad electrónica. Este modelo se describe por un número de parámetros: las posiciones de cada átomo $x_{j}$, $y_{j}$ y $z_{j}$, su factor de temperatura $B_{j}$ representando los deplazamientos de los átomos con respecto a su posición media, etc.​​ La determinación inicial de estos parámetros puede ser incorrecta, debido a errores en la determinación de las fases o fallos de interpretación de la densidad electrónica.​Durante el refinamiento se compara el módulo de los factores de estructura $\mathbf {F} _{c}$ calculados a partir del modelo con el de los derivados del experimento $\mathbf {F}$, y se modifican gradualmente los parámetros hasta que la diferencia sea la menor posible. La figura de mérito utilizada para la comparación es el factor R, definido como:​

$R={\frac {\sum ||\mathbf {F} |-|\mathbf {F} _{c}||}{\sum |\mathbf {F} |}}$

La suma se realiza sobre todas las reflexiones $hkl$.

Se usan dos técnicas matemáticas para ajustar los parámetros del modelo durante el refinamiento: los mínimos cuadrados y la máxima verosimilitud. El segundo método requiere más recursos computacionales, pero es más general y se aplica con preferencia en problemas difíciles, como macromoléculas y difracción a baja resolución.​​

Adquisión de datos

Fuentes de rayos X

Estación de sincrotrón para experimentos de cristalografía usando el método de rotación. El haz de rayos X, de un par de décimas de mm se direge al crystal, de aproximadamente el mismo tamaño, desde la izquierda de la imagen. El cristal se emplaza sobre un difractómetro, que permite orientar y girar el cristal para obtener un conjunto de reflexiones lo más completo posible. El patrón de difracción se graba en el detector bidimensional mostrado a la derecha, en este caso una pantalla de material sensible a los rayos X conectada a una cámara CCD por medio de fibra óptica.

Los experimentos de cristalografía de rayos X se pueden realizar, o bien con un tubo de rayos X o usando la radiación sincrotrón emitida por aceleradores de partículas. En los tubos de rayos X, un haz de electrones producidos por calentamiento de un filamento de wolframio — el cátodo— se aceleran mediante un voltaje aplicado a lo largo del tubo y colisionan contra un material metálico, el ánodo. Los electrones desacelerados, emiten radiación de Bremsstrahlung de espectro continuo — compuesta de múltiple longitudes de onda.— El ánodo absorbe parte de los rayos X emitidos por los electrones y emite a su vez rayos X de las longitudes de onda características del metal. Por ejemplo, un ánodo de cobre emite principalmente en la longitud de onda de 1.5405 Å. La radiación de Bremsstrahlung y otras líneas de emisión características menos intensas se filtran con un metal absorbente. En el ejemplo del ánodo de cobre, se utiliza níquel, que es bastante transparente a los rayos X de 1.5405 Å pero absorbe eficazmente la radiación a longitudes de onda menores, obteniéndose un haz de rayos X bastante monocromático.​ Los rayos de tubos X son relativamente baratos y los laboratorios de investigación los suelen utilizar para realizar experimentos in situ.

La radiación sincrotrón se obtiene cuando un haz de electrones​ acelerados hasta alcanzar una velocidad cercana a la de la luz son desviados de su trayectoria por medio de un campo magnético. La radiación sincrotrón es de espectro continuo y la longitud de onda deseada para el experimento se puede seleccionar mediante un monocromador. Las fuentes de radiación sincrotrón emiten rayos X mucho más intensos que los rayos de tubos X y son necesarias para mejorar la calidad de la difracción para cristales muy pequeños o compuestos de átomos muy ligeros, que interaccionan débilmente con los rayos X.

Detectores

Véase también: Rayos X

Existen varios tipos de detectores usados en los experimentos de cristalografía. El detector bidimensional más usado durante mucho tiempo fue la película fotográfica, actualmente reemplazada por otros detectores más sensibles a los rayos X. Otro detector clásico es el contador proporcional unidimensional, normalmente un detector de centelleo, instalado en un difractómetro y controlado por ordenador. Este tipo de detector mide las reflexiones una a una y todavía se usa para la cristalografía de moléculas pequeñas, pero es poco eficaz en los experimentos con macromoléculas, donde el número de reflexiones ronda entre 10 000 y 100 000.​

A partir de los años 1990 empezaron a aparecer nuevos detectores, como las «placas de imagen» (image plates). Las placas de imagen están recubiertas de un material fosforescente, donde los electrones incrementan su energía al absorber los rayos X difractados y son atrapados en este nivel en centros de color. Los electrones liberan la energía al iluminarse la placa con luz láser, emitiendo luz con intensidad proporcional a la de la reflexión. Estos detectores son un orden de magnitud más sensibles que la película fotográfica y poseen un margen dinámico superior en varios órdenes de magnitud, lo que facilita la medición simultánea de las reflexiones más intensas y las más débiles. Otros detectores usados en la actualidad son detectores electrónicos, conocidos como detectores «de área», que procesan la señal inmediatamente tras la detección de los rayos X. Pueden ser cámaras de ionización o una placa fosforescente acoplada a una cámara CCD.​ En los años 2000 se empezaron a utilizar fotodiodos alineados formando una placa, denominados PAD (Pixel Array Detectors). Estos detectores se caracterizan por un gran margen dinámico y un tiempo muerto entre imágenes muy bajo, del orden de milisegundos.​

Geometrías de difracción

Existen tres métodos para medir la difracción de rayos X: el método de Laue, el método de rotación y el método de polvo.

Método de Laue

Patrón de difracción obtenido por el método de Laue en transmisión: las reflexiones dispuestas a lo largo de una curva son generadas por una misma longitud de onda.

Consiste en hacer incidir en un cristal un espectro continuo de rayos X, de tal manera que para cada longitud de onda se cumple la ley de Bragg para diferentes puntos de la red recíproca. Esto posibilita medir todas o casi todas la reflexiones sin cambiar la orientación del cristal. Existen dos variantes del método de Laue: transmisión y reflexión. En el método de Laue por transmisión, el cristal se emplaza entre la fuente de rayos X y el detector. En método de reflexión, el detector se encuentra entre la fuente y el cristal, para detectar los haces difractados hacia atrás.​

A pesar de ser el método utilizado en los primeros experimentos cristalográficos, el método de Laue se usaba muy poco para la determinación de estructuras debido principalmente a la baja intensidad de la radiación de espectro continua producida por los tubos de rayos X en comparación con la emisión característica monocromática. El creciente uso de la radiación sincrotrón ha fomentado el resurgimiento del método. La capacidad de medir todos los datos necesarios para la determinación de la estructura en un corto tiempo lo convierte en el método más apropiado para el estudio de reacciones químicas que tienen lugar en pocos segundos, como catálisis por enzimas y zeolitas y los efectos de perturbaciones causadas por campos eléctricos, cambios de presión y temperatura, etc. en diversos materiales.​

Métodos de rotación de cristal

Patrón de difracción obtenido por rotación de un cristal. El uso de ordenadores para la interpretación de las imágenes obtenidas por este método lo ha transformado en el modo preferido de medición de datos en la mayoría de las aplicaciones.

Patrón de difracción obtenido por el método de precesión. Este método resulta en una representación sin distorsiones de los planos de la red recíproca.

Se hace incidir un haz de rayos X monocromáticos sobre un cristal, que rota a una velocidad constante alrededor de un eje perpendicular a los rayos X. La rotación del cristal causa que todos los puntos de la red recíproca atraviesen consecutivamente la esfera de Ewald, logrando así medir las reflexiones necesarias. Existen diferentes variantes de este método. En el método de Weissenberg se usa una cámara de forma cilíndrica rodeando al cristal tal que el eje de rotación del cristal coincide con el eje del cilindro. La cámara se traslada a medida que el cristal gira para que las reflexiones estén separadas. En el método de precesión, la cámara es plana, y rota alrededor de un eje paralelo al eje de rotación del cristal. En ambos métodos se usa una pantalla para medir solo una sección bidimensional de la red recíproca en cada imagen.​​ Estos métodos facilitan la determinación de la orientación del cristal y los índices de las reflexiones, pero son lentos e ineficientes. Los avances en computación de los años 90 posibilitaron un diseño más simple, en el que el detector se mantiene estacionario detrás del cristal, usándose programas para hallar automáticamente la orientación y los parámetros cristalinos consistentes con el patrón de difracción observado.​

Método de polvo cristalino

Patrón de difracción de polvo. Debido al uso de múltiples cristales en múltiples orientaciones los puntos de difracción correspondientes a los puntos de la red recíproca a la misma distancia del origen d se unen para formar un anillo.

En el método de polvo cristalino o de Debye-Scherrer,​ el cristal a analizar es pulverizado de tal manera que forme un conjunto de microcristales en todas las posibles orientaciones de la red recíproca. Con esta geometría todas las reflexiones se pueden medir en un solo patrón de difracción, consistente en círculos, uno para cada reflexión. Aunque el método de rotación de cristal resulta en valores más exactos de la intensidad de las reflexiones, el método de polvo es a veces la única opción cuando el material a estudiar no forma monocristales de un tamaño suficiente para producir difracción detectable. Este método se usa mayoritariamente cuando no es necesario determinar la estructura; por ejemplo, en el análisis de minerales presentes en una muestra.​

Aplicaciones

La cristalografía tiene muchas aplicaciones en una gran variedad de disciplinas científicas, como la mineralogía, química, biología molecular, farmacología, geología, física aplicada y ciencia de materiales.​​ Entre los numerosos premios Nobel asociados a la cristalografía,​ una alta proporción se han concedido a aplicaciones de difracción por rayos X o desarrollo metodológico relacionados con esta técnica. La información obtenida a partir de experimentos cristalográficos también se utiliza en campos no directamente relacionados con la investigación científica básica o el desarrollo tecnológico, como la ciencia forense o la historia del arte.​

Análisis de minerales

La cristalografía de rayos X se utiliza no solo para obtener estructuras desconocidas, sino también para determinar la composición de muestras de suelos o minerales, así como para la identificación de metales y otros elementos. Cada sustancia mineral forma cristales con una celda unidad y simetría determinada, que resulta en un patrón de difracción característico. La difracción por el método de polvo es muy usada para este tipo de aplicaciones, por ser sencillo comparar el espaciado entre los anillos de difracción con los valores compilados por el Joint Committee on Powder Diffraction Standars (JCPDS).​ Las proporciones relativas de dos o más minerales presentes en una misma muestra se obtienen comparando las intensidades de sus respectivas líneas con aquellas de muestras de composición conocida. Un ejemplo de esta aplicación es la identificación de minerales arcillosos, la fracción del suelo cuyas partículas minerales tienen un tamaño inferior a 2 μm.​​

Diseño de fármacos

Desde finales de siglo XX se ha empezado a diseñar nuevos fármacos y medicamentos basados en inhibidores y sustratos naturales de diversas proteínas y enzimas involucradas en ciclos celulares y metabólicos. El conocimiento de la estructura de la parte de la proteína — la forma y la distribución de cargas electrostáticas — que liga estos compuestos facilita este proceso, gracias a la mejor comprensión de las interacciones entre la proteína y el ligando de interés; esto permite concentrarse en el diseño de fármacos con las características específicas deseadas.​ Uno de los ejemplos más importantes de esta aplicación es el compuesto vemurafenib, diseñado para bloquear una enzima mutante presente en el 60% de los casos de melanoma.​

Limitaciones

La limitación fundamental de la cristalografía de rayos X consiste en que sólo puede aplicarse a sustancias susceptibles de formar cristales. Aunque las técnicas cristalográficas pueden utilizarse también para determinar la estructura de otros materiales con periodicidad espacial, como fibras helicoidales —ADN, algunos tipos de virus, etc.— y cuasicristales, resulta imposible estudiar gases, líquidos y sólidos desordenados por este método. Además, la obtención de cristales no es siempre suficiente para obtener la estructura de interés: las moléculas de tamaño grande, por ejemplo, suelen ser casos difíciles.​

Efectos de los rayos X en un enlace disulfuro: los átomos de azufre (en naranja) capturan los fotoelectrones emitidos por los átomos presentes en la molécula al ser excitados por los rayos X. Al reducirse, el enlace entre ellos se rompe y se desplazan de su posición original, como indica la desaparición gradual de la densidad electrónica a su alrededor. Esto resulta en un modelo erróneo de la estructura.

Otro límite de la técnica está relacionado con el tipo de información que proporciona sobre la estructura: Los modelos obtenidos por difracción representan una media de las posiciones atómicas para todas las moléculas del cristal; cuando la molécula cuenta con átomos que oscilan entre diferentes conformaciones, la densidad electrónica media se extiende sobre la totalidad del espacio que pueden ocupar estos átomos y las partes desordenadas de la molécula resultan invisibles. Esto representa un serio problema para el estudio de enzimas si el sitio activo de la molécula —asociada a su actividad química— presenta una gran movilidad; en este caso la determinación de las propiedades de materiales biológicos in vivo a partir de su estructura cristalina es problemática y requiere métodos de estudio alternativos, como la resonancia magnética nuclear.

Las vibraciones atómicas también limitan la resolución alcanzable con los datos de difracción, incluso cuando las moléculas adoptan la misma conformación en distintas celdas unidad. La resolución del modelo no suele ser suficiente para determinar el estado de oxidación, posicionar todos los átomos de hidrógeno o distinguir elementos con números atómicos semejantes.​​ La débil interacción de los rayos X con los átomos ligeros es otra desventaja de la técnica en aplicaciones, como la caracterización de nanomateriales.​

Finalmente, las propiedades ionizantes de los rayos X pueden alterar o destruir las moléculas del cristal durante el experimento. Cuando esto ocurre, el modelo obtenido no refleja la verdadera estructura molecular y puede dar lugar a interpretaciones erróneas sobre sus propiedades. Además, las distorsiones globales de la red cristalina y otros efectos secundarios de la irradiación dificultan la obtención de las fases. Este problema es grave en cristales de proteínas, que contienen una alta proporción de agua y compuestos orgánicos fácilmente radiolizables, y un gran número de enlaces químicos susceptibles al ataque por los radicales libres y electrones producidos por dicha radiolisis. los experimentos con moléculas biológicas se suelen realizar a temperaturas de 100 K o menores; esto frena la difusión de los radicales libres, aunque no soluciona enteramente el problema, pues los fotoelectrones excitados por los rayos X permanecen móviles hasta el cero absoluto.​​

Véase también

• Cristalografía
• Difracción de electrones
• Difracción de neutrones
• Espectroscopia de rayos X
• Resonancia magnética nuclear

Referencias

Bibliografía

• Brindley, G. y Brown, G. "Crystal structures of clay minerals and their X-Ray identification", Mineralogical Society, London (1980).
• Drenth, Jan (1999). Principles of protein x-ray crystallography (en inglés) (2ª edición). Springer. ISBN 9780387985879. 
• Helliwell, John R. (1992). Macromolecular Crystallography with Synchrotron Radiation (en inglés). Cambridge University Press. ISBN 0-521-33467-5. 
• Luger, Peter (1980). Modern x-ray analysis on single crystals (en inglés). Walter de Gruyter. ISBN 3-11-006830-3. 
• Stout, George H.; Jensen, Lyle H. (1989). X-ray structure determination — A practical guide (en inglés) (2ª edición). John Wiley & sons. ISBN 0-471-60711-8. 

Enlaces externos

• Portal de Cristalografía del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de España
• Unión Internacional de Cristalografía (en inglés)